一种用于SARS-CoV-2进入受体核成像的工具：ACE2选择性放射肽的分子模型与临床前开发

Darja Beyer et al., 2023, EJNMMI Research

2019冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的传染病，世界卫生组织于2020年3月宣布其为大流行病，目前已成为对全球社会构成重大威胁的健康问题。大量的病毒变异株导致了COVID-19在病理表现、症状严重程度和长期影响等方面的多样性。SARS-CoV-2利用血管紧张素转换酶2（ACE2）作为入侵宿主细胞的受体。ACE2于2000年被发现，被认为是心血管调节过程中的关键酶。ACE2的催化结构域与其同源物血管紧张素转换酶（ACE）有42%的序列同一性，但这两种酶在底物选择性和生理功能上存在差异。重要的是，ACE2不与卡托普利或赖诺普利等ACE抑制剂结合，而这些抑制剂是治疗高血压的常用药物。ACE2具有抗高血压和心脏保护作用，并在肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）中充当ACE的反向调节剂。研究发现，ACE2在心血管系统、肺、肾、肠和睾丸中高表达。毫不奇怪，其中一些组织已被确定为COVID-19病理表现的关键部位。

ACE2表达的复杂调控机制，包括SARS-CoV-2感染后的动态变化，可能是COVID-19表现出从无症状到致命重症等多种临床表现和疾病进展的原因之一。一些研究认为，ACE2表达水平与疾病严重程度呈正相关，因为ACE2表达增加会促进病毒传播，并认为儿童ACE2水平较低可保护他们免受严重SARS-CoV-2感染。另一些研究则表明，老年人ACE2表达水平低可能导致预后不良。关于年龄相关ACE2表达的矛盾说法可能源于个体间的巨大差异、ACE2降解的细胞类型依赖性最大年龄，以及mRNA和蛋白质水平并不完全对应的事实。还有一种理论认为，SARS-CoV-2感染会导致ACE2降解，从而无法平衡RAAS中ACE的作用，可能导致促炎状态，进而增加疾病进展为重症的风险。

ACE2表达水平和动态变化影响COVID-19严重程度这一假说得到了进一步支持，因为观察发现：能够影响ACE2表达水平的疾病（如高血压、糖尿病和肥胖）、遗传易感性以及某些药物，均为已知的COVID-19重症表型风险因素。

深入理解ACE2表达动态变化，将其作为预测感染易感性和疾病进展的手段，或许有助于识别高危患者，并制定更具个体化的治疗策略。尽管已有研究尝试在mRNA和蛋白质水平上测定不同组织中的ACE2，但无创成像技术也能直接在患者体内测定其表达动态。

在临床使用的成像技术中，单光子发射计算机断层扫描（SPECT）的应用仍多于正电子发射断层扫描（PET）。然而，PET具有图像分辨率更高、灵敏度更强以及可精确定量等显著优势，因此更适用于多种疾病（包括心血管疾病）的（病理）生理过程分子成像。早期临床前研究通过碘-124标记病毒刺突蛋白的受体结合域，尝试开发可视化ACE2的PET显像剂。其他研究团队则利用二硫键桥连的DX600（最初开发为ACE2特异性抑制剂），将其与DOTA或NODAGA螯合剂衍生化，以实现镓-68（PET放射性核素）的配位结合。一种NOTA衍生化的DX600肽（称为DX600-BCH）被开发用于铝-氟-18的配位，目前已进入临床试验（NCT04542863），以验证ACE2无创成像的可行性。

作者旨在对基于DX600的放射性肽用于ACE2无创PET成像进行更深入研究。借助分子建模，设计了三种分别携带DOTA、NODAGA或HBED-CC螯合剂的肽段。由于镓-67（半衰期=3.26天）具有更便利的半衰期且可用于SPECT，因此将其作为镓-68（半衰期=68分钟）的替代放射性同位素，对三种DX600肽进行标记后评估。通过ACE2和ACE转染的人胚肾（HEK）细胞及相应的异种移植小鼠模型，评估了DX600基放射性肽对ACE2的选择性。此外，基于缓激肽增强肽-9a（BPP9a）结构合成了ACE特异性放射性肽，并对其进行金属螯合衍生化，以验证体外和体内模型的有效性。

SPECT/CT成像采用四探头、多模式、多针孔小动物SPECT相机（NanoSPECT/CT™）进行。每个探头配备钨基孔径，含9个直径1.4 mm、厚度10 mm的针孔。CT扫描持续7.5分钟，随后在注射各放射性肽（10 MBq，0.5 nmol，100 μL，用含0.05% BSA的0.9% NaCl稀释）后1小时、3小时和24小时进行约50分钟的SPECT扫描。扫描期间，小鼠用异氟烷和氧气混合气体麻醉。图像通过Nucline软件采集，实时CT重建采用锥束滤波反投影法。SPECT数据重建使用HiSPECT软件，针对镓-67选择93.20 keV（±10%）、184.60 keV（±10%）和300.00 keV（±10%）的γ能量。所有图像通过VivoQuant后处理软件制备，应用高斯重建后滤波（半高全宽1 mm），镓-67的活性刻度按SPECT/CT图像所示设置。为评估DX600基放射性肽随时间从HEK-ACE2异种移植物和肾脏中的清除情况，使用VivoQuant定量工具测定这些组织中的绝对活性。将1小时注射后（p.i.）时间点的异种移植物和肾脏累积活性（非衰减校正值，单位MBq）设为100%，并根据3小时和24小时p.i.测定的绝对活性计算这些组织中保留的活性百分比。

在注射DX600基放射性肽后1小时和3小时对小鼠进行的SPECT/CT成像研究显示，活性在表达ACE2的异种移植物中累积，而在表达ACE的异种移植物中无累积。放射性肽在HEK-ACE2异种移植物中保留良好，与1小时p.i.时间点相比，3小时和24小时后异种移植物中仍分别保留约92-95%和47-58%的活性。所有三种放射性肽均因肾脏排泄而在肾脏中滞留，其中[⁶⁷Ga]Ga-DOTA-DX600和[⁶⁷Ga]Ga-NODAGA-DX600注射后尤为显著（图7A/B）：1小时p.i.测定的活性在3小时后仍保留约85%，24小时后仍保留约35-45%。对于[⁶⁷Ga]Ga-HBED-CC-DX600，肾脏清除速度显著加快（图7C），3小时后肾脏中仅剩余1小时p.i.测定活性的30%；24小时后，[⁶⁷Ga]Ga-HBED-CC-DX600已完全从肾脏排泄（<1小时p.i.测定活性的1%）。

>作者的数据表明，[⁶⁷Ga]Ga-HBED-CC-DX600是一种极具潜力的核成像剂，可用于研究ACE2在体内的表达谱和动态变化，从而加深对COVID-19病理机制的理解。

>[⁶⁷Ga]Ga-HBED-CC-DX600的生物分布性能优于其他采用DOTA或NODAGA螯合剂的DX600基放射性肽。重要的是，HBED-CC螯合剂能够实现高摩尔活性的⁶⁷Ga标记，这对于获得高信噪比图像以检测患者体内（病理）生理性ACE2表达水平至关重要。