一种针对骨质疏松和肥胖的多功能FSH阻断疗法

Sakshi Gera et al, bioRxiv, 2022

过去十年的药理学与遗传学研究证实，卵泡刺激素（FSH）已成为影响数百万人疾病（特别是骨质疏松症、肥胖症和阿尔茨海默病）的可干预靶点。阻断FSH作用可防止小鼠骨质流失、脂肪堆积及阿尔茨海默病相关表征。本课题组近期开发出一种首创型、人源化、表位特异性的FSH阻断抗体MSHu6，并报道了该抗体在小鼠中预防肥胖与骨质疏松的效果，以及在猴子中的急性安全性参数。

通过在小鼠和猴子中使用⁸⁹Zr标记、生物素化或未标记的MSHu6进行生物分布研究，发现该抗体定位于骨骼、骨髓和脂肪储存组织。在人源化Tg32小鼠中，MSHu6的β相半衰期为13天（316小时），并能结合内源性FSH。研究通过蛋白热位移分析测试了215种辅料配方，最终获得一种冻融后及不同温度下溶液稳定性高、聚集极少、无自身/交叉/疏水相互作用、且与相关人源抗原无明显结合的最终制剂。计算机模拟显示MSHu6具有与人IgG1同等水平的"人源化程度"；在人外周血单个核细胞培养的ELISPOT实验中，MSHu6未引发IL-2和IFNγ免疫反应。结果表明，MSHu6具有疗效持久、可规模化生产的特点，因此有望作为一种多用途治疗药物进入未来的人体试验。

在Fcgrt-/-背景下表达人类FcRn受体（由位于2号染色体上的FCGRT转基因编码）的C57BL/6或Tg32小鼠，通过眶后静脉窦单次注射约250 μCi（约250 μg）的⁸⁹Zr–MS-Hu6。随后在预定时间点采集血液（从尾静脉取数滴）和排泄物，经称重后进行γ计数。

为研究⁸⁹Zr–MS-Hu6的生物分布，我们在注射后24、48和72小时对小鼠（N=3只）进行PET/CT扫描。扫描采用nanoScan® PET/CT系统完成。全身CT扫描参数如下：能量50 kVp，电流180 μAs，各向同性体素尺寸0.25 mm；随后进行30分钟PET扫描。图像重建使用Mediso Nucline软件的TeraTomo 3D重建算法，并应用衰减校正。符合事件采用400-600 keV能量窗进行过滤，体素尺寸为各向同性0.4 mm，重建过程执行4次完整迭代，每次迭代包含6个子集。影像分析采用Osirix MD软件完成，具体将CT全身影像与PET影像进行融合，并在轴位平面上进行分析。

在多个组织区域绘制了感兴趣区(ROI)。睾丸、内脏白色脂肪组织(WAT)、皮下白色脂肪组织、肾脏、肝脏及大脑被完整勾画轮廓，骨髓摄取情况通过腰椎三节椎骨进行评估。计算各ROI的平均标准化摄取值(SUV，均以肌肉组织为参照进行标准化)。随后，各组织的⁸⁹Zr–MS-Hu6摄取量以该器官所有平均SUV值的算术平均数表示。完成影像采集后，处死小鼠并进行20毫升PBS灌流，随后分离目标组织（包括脑、心脏、肾脏、胰腺、肝脏、肺、骨骼、骨髓、棕色脂肪组织(BAT)、皮下白色脂肪组织、内脏白色脂肪组织、肾上腺、血液、睾丸、脾脏及肌肉）用于γ计数检测。

图像显示，循环放射性活度在24小时后出现衰减迹象，但在多个器官中可持续存在长达72小时（图5A）。

为确定⁸⁹Zr–MS-Hu6在各类组织中的存留程度，我们在处死小鼠前用20毫升PBS进行全身灌注，随后分离组织进行γ计数。多个器官中均检测到显著浓度的⁸⁹Zr–MS-Hu6，包括骨骼、骨髓、皮下白色脂肪组织、内脏白色脂肪组织及棕色脂肪组织（图5C）。在分离的脑组织中，72小时后仅检测到微量⁸⁹Zr–MS-Hu6——这与免疫球蛋白G对血脑屏障的低穿透率（0.05%至0.1%）相符（图5C）。

为补充⁸⁹Zr标记的生物分布研究，我们将MS-Hu6用Alexa-Fluor-750（AF750）进行荧光标记，通过尾静脉分别向C57BL/6小鼠（N=3只）注射AF750–MS-Hu6（200 μg）、单纯AF750或PBS。注射16小时后，对麻醉小鼠进行IVIS平台成像。我们发现AF750–MS-Hu6在软组织中分布显著（图5F）。随后对小鼠进行PBS灌注，并对离体组织进行IVIS成像。与Zr-89研究结果一致，AF750–MS-Hu6在肝脏、肾脏、脂肪组织、骨骼和大脑中均有摄取（图5G）。相比之下，单纯AF750（仅染料）对照组仅因染料排泄在肾脏中观察到定位，其他器官均未出现。

额外结果显示：

〉与注射人源IgG的小鼠相比，注射MS-Hu6的小鼠摄食量有所增加。尽管存在这一趋势，MS-Hu6组小鼠的体重却出现下降，其中第7周和第8周的体重下降具有统计学意义。定量PCR检测显示，MS-Hu6组小鼠皮下脂肪、性腺周围白色脂肪组织（WAT）及棕色脂肪组织（BAT）中脂肪相关基因（Pparg、Fabp4和Cebpa）的表达均有所降低。经过8周的MS-Hu6干预后，小鼠血清中的促黄体生成素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH）和睾酮水平未发生明显变化。

〉股骨干骺端的组织形态计量学分析显示，骨体积分数和骨小梁厚度显著增加，但骨小梁数量未见明显变化。

图5：MS-Hu6在小鼠和猴子体内的生物分布与排泄。 (A) 单次推注⁸⁹Zr标记的MS-Hu6 (250 μCi) 后，小鼠在24、48和72小时的PET-CT代表性图像；(B) 不同器官中以标准摄取值单位（SUV，以肌肉为参照标准化）进行的定量分析（三个时间点的小鼠数量分别为N=5、4和2）。(C) 用20 mL PBS灌流小鼠后，分离的各组织中⁸⁹Zr–MS-Hu6的含量（γ计数）（三个时间点的小鼠数量分别为N=5、4和5）。(D) 显示⁸⁹Zr–MS-Hu6在240分钟内摄取的动态PET/CT图像。(E) 粪便中⁸⁹Zr标记的MS-Hu6的排泄时程（每个时间点N=5只小鼠）。(F) 注射AF750-MS-Hu6 (200 μg) 或PBS的C57BL/6小鼠，在IVIS成像中显示的全身发射荧光强度。(G) 注射AF750-MS-Hu6、AF750或PBS后，分离的灌流组织的IVIS成像及定量分析（平均荧光强度）如图所示（每组N=3只小鼠）。

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