负载肌红蛋白的钆纳米噻吩并吡咯啉用于氧协同和影像引导的放射增敏治疗
Darja Beyer et al., 2023, EJNMMI Research
总结
本研究通过自组装纳米囊泡（称为钆-纳米噻吩甲酰苯肼（Gd-NTs））来探索钆配位噻吩甲酰苯肼（Gd-Tex）放射增敏的增强效果。通过掺入肌红蛋白（Mb），所得Mb@Gd-NTs可缓解肿瘤缺氧，显著提高Gd-Tex的放射增敏效果。这种多功能纳米平台还可螯合177Lu3+（Mb@177Lu/Gd-NTs），用于双模态成像。这种“一网打尽”的纳米平台在影像引导的放射增敏治疗中具有广阔的临床应用潜力。研究人员开发了钆纳米噻吩甲酰苯肼（Gd-NTs），通过自组装和肌红蛋白负载，增强了Gd配位噻吩甲酰苯肼的放射增敏效果，缓解了肿瘤缺氧并抑制了放疗后的复发。放疗（RT）虽然有效，但存在局限性，包括可能对正常组织造成损伤和复发。钆配位噻吩甲酰苯肼（Gd-Tex）是一种有前景的放射增敏剂，但其效果有限。研究人员将Gd-Tex转化为Gd-NTs，即具有脂质双层的纳米囊泡，显著提高了肿瘤积聚和放射增敏效果，解决了放疗中的一个关键挑战。
Mb@177Lu/Gd-NTs的制备与表征。
a Mb@177Lu/Gd-NTs的制备示意图。b 影像引导放射增敏治疗的示意图。静脉注射Mb@177Lu/Gd-NTs可实现SPECT/MRI双模态成像，以实时准确监测药物递送情况。Mb@177Lu/Gd-NTs可显著增加Gd-Tex在肿瘤中的积聚，并明显缓解肿瘤缺氧。O2协同增强Gd-Tex的放射增敏作用，导致肿瘤细胞中还原剂减少、活性氧（ROS）增加，从而增强细胞凋亡，最终诱导长期的免疫抗肿瘤记忆。c, d Gd-NTs（I）和Mb@Gd-NTs（II）的透射电子显微镜（TEM）图像（c）和水动力直径分布（d）。比例尺，100 nm。这些实验（c, d）独立重复三次，结果相似。e Tex-脂质、Gd-Tex-脂质和Gd-NTs的紫外-可见光吸收光谱。实验（e）独立重复三次，结果相似。f 不同浓度MbO2@Gd-NTs（0-80 μg/mL Mb）释放的溶解氧浓度。g 游离血红蛋白（Hb）、HbO2@NTs、游离Mb和MbO2@NTs（40 μg/mL Hb或Mb）释放的溶解氧浓度。MbO2，氧合Mb。HbO2，氧合Hb。这些实验（f, g）独立重复三次，结果相似。h 缺氧条件下NTs、MbO2@NTs、Gd-NTs、MbO2@Gd-NTs催化的抗坏血酸氧化动力学。数据（h）表示为平均值±标准差（n=3次独立实验）。源数据以源数据文件的形式提供。
通过将肌红蛋白负载到钆纳米管（Gd-NTs）中（Mb@Gd-NTs），可增强Gd-Tex的放射增敏效果，缓解肿瘤缺氧并改善Gd-Tex的放射增敏作用。该纳米平台能够螯合用于MRI的Gd3+和用于SPECT成像的177Lu3+，从而可实时追踪药物递送情况，显示出在影像引导放射增敏治疗方面的潜力，具有广阔的临床应用前景。
材料与方法
材料来源如下：乙酸钆水合物和骨骼肌肌红蛋白（Mb）购自Sigma–Aldrich（美国），三乙胺购自Alfa Aesar（美国），脂质成分（DSPC、DSPE-mPEG2000、胆固醇）购自Avanti Polar Lipids（美国）。细胞培养用品购自Corning（美国）。免疫检测试剂盒包括北京诚志科威生物技术有限公司（中国）的小鼠IFN-γ ELISA试剂盒（CZM10-96）和NeoBioscience Technology Co., Ltd.（中国）的小鼠IL-1β ELISA试剂盒（EMC001bQT）。超纯水通过Millipore Milli-Q Gradient System（美国）获得。用于蛋白质检测和流式细胞术的抗体购自不同供应商：Abcam（美国）的兔抗γ-H2A.X（磷酸化S139）抗体和FITC偶联的山羊抗兔IgG H&L抗体。流式细胞术抗体购自BioLegend（美国）。根据给药前的生物发光成像结果，将小鼠随机分组，确保各组平均肿瘤大小相当。纳米囊泡行为的体内追踪采用SPECT、MRI和荧光成像技术，并通过相应软件对感兴趣区域（ROI）的信号强度进行量化。每组至少包含三只小鼠，以进行稳健的统计分析，且进行动物实验的研究人员对分组信息并不知情。
Mb@177Lu/Gd-NTs的SPECT/CT成像和生物分布研究
〉使用nanoScan SPECT/CT系统对携带LLC肿瘤的小鼠进行小动物SPECT/CT成像。
〉每只小鼠接受400 μCi的Mb@177Lu/Gd-NTs静脉注射后，分别在注射后2、12、24、48和72小时进行SPECT/CT成像。使用OSEM算法重建SPECT图像，并生成与锥形束CT的融合图像。对携带LLC肿瘤的小鼠（肿瘤体积约100 mm3）进行生物分布研究，注射50 μCi的Mb@177Lu/Gd-NTs，然后在注射后6、24、48和72小时处死小鼠。
〉收集组织样本，称重，并使用自动γ计数器测量其放射性活性，以计算每克组织中注射剂量的百分比（%ID/g）。
单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和磁共振成像（MRI）双模态成像、药代动力学和生物分布研究
〉在研究用于磁共振成像（MRI）对比的Mb@Gd-NTs时，我们评估了其在7T磁场下的体外效果，结果显示其显著增强，r1值为0.62 mM−1 S−1。
〉表面活性剂解离的Mb@Gd-NTs表现出更高的r1值（0.77 mM−1 S−1），表明其在肿瘤细胞内吞后对比度有所提高。
〉静脉注射Mb@Gd-NTs显著增强了肿瘤区域的MRI信号，在注射后24小时达到峰值，表明药物在肿瘤内大量积聚。
Mb@Gd-NTs的MRI/SPECT/CT成像、药代动力学和生物分布。
a 不同浓度Mb@Gd-NTs的体外体模MRI对比图像。b R1（1/T1）值作为不同浓度Gd-Tex-脂质和完整或解离的Mb@Gd-NTs的r1值的函数进行线性拟合。c 注射Mb@Gd-NTs前以及注射后4小时、24小时和48小时的LLC荷瘤小鼠体内T1加权MRI成像。d 静脉注射Mb@177Lu/Gd-NTs后2至72小时获取的LLC荷瘤小鼠SPECT/CT图像。这些实验（a-d）独立重复三次，结果相似。e 注射后6、24、48和72小时测量的Mb@177Lu/Gd-NTs在肿瘤和主要器官中的生物分布。数据（e）以平均值±标准差（n=4只小鼠）表示。f 静脉注射游离Cy5.5-Mb、Cy5.5-Mb@NTs和Cy5.5-Mb@Gd-NTs后0.5至72小时的LLC荷瘤小鼠体内荧光成像（n=4只小鼠，参见补充图9）。g 注射游离Cy5.5-Mb后2小时和注射Cy5.5-Mb@NTs、Cy5.5-Hb@NTs和Cy5.5-Mb@Gd-NTs后24小时，肺、肌肉和肿瘤中Cy5.5-Mb或Cy5.5-Hb的含量。数据（g）以平均值±标准差（n=4只小鼠）表示。h Cy5.5标记的不同制剂的药代动力学研究。数据（h）以平均值±标准差（n=4只小鼠）表示。i, j 肿瘤组织切片低氧区域（假红色）的免疫荧光染色和相应的半定量结果（j）。细胞核用DAPI染色（假蓝色）。 在注射游离肌红蛋白（Mb）后2小时以及注射不同脂质体后24小时，从小鼠体内切除肿瘤。比例尺，60微米。数据（j）表示为平均值±标准差（n=6只小鼠）。统计分析采用双尾非配对t检验（g、h、j）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。源数据以源数据文件的形式提供。
〉用于SPECT成像的177Lu放射性标记的Mb@Gd-NTs显示出清晰的肿瘤可视化效果，在注射后24小时达到峰值摄取，与MRI结果一致。
〉生物分布结果显示，纳米颗粒在肿瘤、肝脏和脾脏中显著积聚，这是纳米颗粒的典型行为。
〉24小时时，Mb@Gd-NTs的肿瘤摄取量最高（6.92 %ID/g）。与游离的Cy5.5-Mb相比，用Cy5.5标记的Mb@Gd-NTs进行的荧光成像显示其肿瘤滞留效果更佳。
〉定量分析证实，由于延长了血液循环时间，Mb@Gd-NTs的肿瘤摄取量高出7.88倍。药代动力学研究表明，与游离Mb相比，Mb@Gd-NTs的半衰期显著延长。
〉Mb@Gd-NTs有效缓解了肿瘤乏氧，效果优于Hb@Gd-NTs。结果表明，Mb@Gd-NTs在治疗规划中具有影像引导剂量测定的潜力。
将Mb（肌红蛋白）纳入纳米平台延长了其半衰期，并增强了其在缓解缺氧方面的有效性。这种多功能且具有生物相容性的纳米平台，兼具放射增敏和SPECT/MRI成像功能，在影像引导放射治疗的临床应用中具有巨大潜力。
